Identificación de tejido tumoral en muestras patológicas delgadas mediante láser de femtosegundo

Apr 07, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9250 (2023) Citar este artículo

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En el tratamiento de la mayoría de los tumores cancerosos sólidos descubiertos recientemente, la cirugía sigue siendo la primera opción de tratamiento. Un factor importante en el éxito de estas operaciones es la identificación precisa de los márgenes de seguridad oncológica para asegurar la extirpación completa del tumor sin afectar gran parte del tejido sano vecino. Aquí informamos sobre la posibilidad de aplicar la espectroscopia de ruptura inducida por láser de femtosegundos (LIBS) combinada con algoritmos de aprendizaje automático como una técnica de discriminación alternativa para diferenciar el tejido canceroso. Los espectros de emisión después de la ablación en muestras postoperatorias de hígado y mama fijadas delgadas se registraron con alta resolución espacial; las secciones teñidas adyacentes sirvieron como referencia para la identificación del tejido mediante análisis patológico clásico. En una prueba de prueba de principio realizada en tejido hepático, los algoritmos de redes neuronales artificiales y bosques aleatorios pudieron diferenciar tanto el tejido sano como el tumoral con una precisión de clasificación muy alta de alrededor de 0,95. La capacidad de identificar tejido desconocido se realizó en muestras de mama de diferentes pacientes, proporcionando también un alto nivel de discriminación. Nuestros resultados muestran que LIBS con láser de femtosegundo es una técnica con potencial para ser utilizada en aplicaciones clínicas para la identificación rápida del tipo de tejido en el campo quirúrgico intraoperatorio.

La cirugía sigue siendo la principal línea de ataque para erradicar el cáncer descubierto en sus primeras etapas. La mayoría de los tumores sólidos recién diagnosticados se extirpan mediante cirugía, con la esperanza de una cura completa o al menos prolongar la esperanza de vida del paciente1. Las células cancerosas que quedan después de la operación (p. ej., por los márgenes positivos de la muestra de resección) pueden generar recurrencias locales o metástasis con el tiempo, siendo uno de los factores clave que determinan la tasa de supervivencia de un paciente. En muchos casos, son necesarias intervenciones quirúrgicas posteriores para extirpar el tejido neoplásico recién formado, o terapias adyuvantes (radioterapia o quimioterapia), que tienen muchos efectos secundarios. Los resultados de la cirugía están determinados principalmente por la experiencia del equipo médico que realiza la intervención oncológica: el objetivo es eliminar por completo las células malignas (para evitar nuevas recurrencias) y preservar la mayor cantidad de tejido posible del órgano afectado, para no degradar su funcionalidad. En la práctica, los márgenes de seguridad oncológica varían entre 2 mm y 1 cm, según el tipo de cáncer y la localización del tumor2. La localización de alta precisión del tumor es de crucial importancia para el éxito de la operación. El equipo quirúrgico puede utilizar la información obtenida antes de la operación a partir de técnicas de imagen (tomografía por resonancia magnética, tomografía computarizada de rayos X o ecografía), pero en el campo operatorio las decisiones se basan principalmente en información visual y táctil. Muchas veces, para decidir si el tejido maligno se ha eliminado por completo, se utiliza el examen patológico intraoperatorio en una muestra congelada. Este procedimiento requiere varias decenas de minutos y, en caso de incertidumbre, aumentaría significativamente el tiempo operatorio, aumentando el riesgo de complicaciones. Por ello, es muy deseable una técnica alternativa o complementaria con un establecimiento rápido y preciso del tipo de tejido intervenido.

En los últimos años, se han investigado varias técnicas innovadoras para el análisis in vivo. Las técnicas de espectroscopia de masas, en las que se miden los valores de masa/carga de diferentes fragmentos moleculares resultantes de la descomposición local del tejido, ya se han probado in vivo para identificar diferentes tipos de cáncer3,4,5. Paralelamente a estas, se han investigado técnicas ópticas, como la tomografía de coherencia óptica6,7, la espectroscopia Raman8,9,10 y la espectroscopia de ruptura inducida por láser (LIBS), debido a su portabilidad y alta precisión espacial. Si bien los primeros intentos de utilizar LIBS para detectar tejido canceroso se remontan a casi dos décadas11, el desarrollo en los últimos años de algoritmos de Machine Learning (ML) para interpretar un gran volumen de datos experimentales ha intensificado estos estudios12. La técnica LIBS analiza los espectros de emisión del plasma creado por láseres enfocados en la superficie de los materiales. Tiene la ventaja de producir resultados rápidos en una amplia variedad de muestras que no requieren un pretratamiento complicado. En el proceso LIBS, el material se ioniza y se produce plasma, que al enfriarse emitirá una radiación específica de los elementos químicos existentes en el material. Muchos estudios que tratan de identificar diferentes tipos de tejido maligno se realizan utilizando láseres de nanosegundos12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22, que producen plasma a alta temperatura con un daño térmico significativo en la muestra y una disminución en la resolución espacial23. En estudios anteriores, hemos demostrado que los pulsos de femtosegundos (fs) se pueden utilizar para el análisis LIBS in situ/in vivo de precisión de tejido biológico23 y muestras técnicas24, lo que permite una resolución espacial del orden de micras e inferior a 25. Aplicaciones de fs-LIBS en diferentes tejidos biológicos se presentan en varios estudios (Ref.26 y referencias en el mismo), pero su uso en la detección de tejido canceroso ha sido menos investigado12,27,28,29.

Este artículo presenta nuestros resultados en la identificación de cáncer de hígado y de mama en muestras patológicas humanas estándar utilizando algoritmos fs-LIBS y ML. Usando las ventajas de los pulsos de láser ultracortos, pudimos registrar espectros de emisión atómica y molecular luego de la ablación en muestras muy delgadas con espesores de unas pocas micras. El tipo de tejido a partir del cual se origina el espectro registrado (utilizado en el entrenamiento y evaluación de algoritmos de ML) podría identificarse por comparación directa con los resultados del análisis patológico en cortes adyacentes. Hasta donde sabemos, este tipo de análisis en muestras de espesor micrométrico se realizó solo en un estudio reciente sobre tejido tumoral gastrointestinal utilizando pulsos de láser ns22, pero los espectros presentados en esta publicación tienen una fuerte contribución espectral del sustrato, con muchas emisiones. líneas superpuestas con las provenientes del tejido biológico. Usando pulsos de láser ultracortos y un sustrato de cuarzo de alta pureza, realizamos la ablación con una alta resolución espacial y un bajo daño colateral, y los espectros registrados contienen solo contribuciones de la muestra.

El documento está estructurado de la siguiente manera: la siguiente sección presenta el procedimiento experimental y la información de preparación de muestras. Luego, fs-LIBS y ML se prueban con tejido hepático para observar si los espectros obtenidos de muestras patológicas muy delgadas se pueden usar para identificar el tipo de tejido. Además, en esta sección se investiga la reproducibilidad de las medidas a través de comparaciones entre los datos registrados en diferentes días. La última sección presenta los resultados obtenidos del cáncer de mama y cómo los algoritmos ya entrenados en algunos pacientes pueden usarse para detectar células cancerosas en un paciente diferente.

Se generaron pulsos láser con un ancho temporal de 30 fs a una longitud de onda central de 785 nm y una tasa de repetición de 1 kHz mediante un sistema láser Ti:Sapphire amplificado (Femtolasers, Femtopower Pro). La tasa de repetición se reduce a un solo disparo mediante el uso de la celda de Pockels (como un selector de pulso electro-óptico) dentro del amplificador. La luz polarizada linealmente se guió a un modelador de pulsos casero de alta precisión30,31, donde la dispersión general de los elementos ópticos hasta la superficie de la muestra se compensó utilizando una señal de fotodiodo de dos fotones como retroalimentación. Entre el sistema láser y la plataforma del microscopio, tenemos varios componentes ópticos para variar y registrar la energía de los pulsos. La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de la configuración de fs-LIBS utilizada en este estudio. Los componentes principales de la plataforma del microscopio son una cámara de monitoreo para el posicionamiento de la muestra, una platina de traslación XYZ controlada por motor paso a paso (PI miCos) y una platina de inclinación para hacer que la superficie de la muestra sea paralela a las direcciones de movimiento x e y de la platina. . Un objetivo Mitutoyo Plan Apo 10X con una apertura numérica (NA) de 0,28 y una distancia de trabajo de 34 mm enfoca los pulsos láser a un radio de haz medido de 3,5 µm (a \(1/{e}^{2}\) de intensidad) en la muestra. Con un rango de Rayleigh por debajo de 12 µm, el plasma se crea en la muestra biológica delgada, lo que produce una ablación mínima del material del sustrato. Las mediciones se realizaron a temperatura ambiente en una atmósfera de aire, utilizando una energía por pulso de \(7\pm 0,5 \mu \mathrm{J}\) y una intensidad máxima correspondiente de aproximadamente \(5\times {10}^{14 }\mathrm{ W}/{\mathrm{cm}}^{2}\), lo que asegura una buena relación señal-ruido con una contribución espectral muy baja del sustrato.

Representación esquemática del montaje experimental.

Para cada ubicación seleccionada en la muestra con un tipo de tejido preidentificado, realizamos la ablación de una matriz de 10 × 10 en un régimen de disparo único del láser; después de registrar el espectro del plasma creado por cada pulso de láser, la muestra se movió una distancia de punto a punto de 25 µm.

La luz emitida por el plasma inducido por láser se recogió con una NA de 0,22 mediante un sistema de dos lentes de sílice fundida colocadas a 45° cerca del objetivo del microscopio y se transportó a través de una fibra óptica hasta la rendija de entrada de 50 µm del espectrómetro (LOT Oriel Multispec MS125). Para este experimento, utilizamos una rejilla con 400 líneas/mm y un resplandor de 500 nm (LOT Oriel 77417), que aseguró una resolución espectral de alrededor de 1 nm. Se conectó un ICCD PIMAX de Roper Scientific intensificado al espectrómetro para registrar los espectros. La calibración de longitud de onda se realizó con una lámpara de calibración (LOT Oriel Pen Ray 6035 Hg(Ar)) sin calibración de intensidad.

La adquisición de datos se sincronizó con el sistema láser. El generador de temporización programable de la cámara controla el retardo y el tiempo de exposición (puerta) de la grabación con una precisión de ns. Para la emisión de fs-LIBS, usamos un retraso de 23 ns después del pulso láser y un tiempo de puerta de 500 ns para suprimir la emisión supercontinua del pulso láser y el fondo de banda ancha del bremsstrahlung continuo. Cada espectro se guardó y se etiquetó de acuerdo con el tipo de tejido.

Se investigaron muestras de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina de hígado humano que contenían una metástasis de cáncer colorrectal, tejido mamario con tumor primario, así como un ganglio linfático con cáncer de mama metastásico. Se prepararon secciones delgadas seriadas de 10 µm de cada bloque de parafina con un micrótomo y la parafina se eliminó disolviéndola posteriormente con xileno, alcohol y agua de acuerdo con los protocolos estándar32. Las rebanadas más externas de la pila se tiñeron con un protocolo estándar de H&E (hematoxilina y eosina) para identificar regiones de tejido sano y canceroso (Fig. 2a). De esta forma, cada conjunto de dos o tres portaobjetos LIBS se encapsuló con un par de portaobjetos de referencia y podemos utilizar el análisis patológico clásico mediante inspección óptica en los cortes exteriores teñidos para seleccionar las ubicaciones correspondientes en los cortes interiores para la investigación espectral con alta certeza. Los cortes con tamaños laterales de alrededor de 2 × 1,5 cm se colocaron en un portaobjetos de microscopía. En el análisis LIBS en muestras muy finas, un tema importante es la elección del sustrato28, que puede presentar fuertes líneas espectrales de impurezas22. Por esta razón, hemos elegido sustratos de vidrio de cuarzo de alta pureza (Plano GmbH), donde las únicas líneas de emisión presentes en el rango espectral medido son las de silicio (Si), como se puede ver en la inserción en la Fig. 3. Como el silicio está presente en cantidades insignificantes en los tejidos biológicos de mama e hígado analizados33,34, eliminamos los espectros con señales significativas de Si porque solo pueden originarse en el sustrato. Otra forma de evitar problemas de sustrato (y obtener señales más altas) serían cortes más gruesos, pero son difíciles de obtener y manipular mediante este procedimiento.

Representación esquemática de la preparación de la muestra en (a) e imágenes microscópicas de los dos tipos de tejido (hígado en (b) y mama en (c)). Las marcas rojas en (b) y (c) indican regiones tumorales puras, mientras que las marcas azules muestran regiones sanas puras. Las áreas restantes contienen una mezcla de células tumorales y sanas. El recuadro en (b) muestra la imagen de una matriz ablacionada superpuesta al área correspondiente en la imagen de referencia.

Espectros hepáticos preprocesados ​​(resta de línea de base y normalización de vectores) de ambas clases (rojo = "Tumor", azul = "Sano", incluida la distribución de señal respectiva de cada longitud de onda dentro del conjunto de datos indicado por los tonos de color correspondientes. La inserción en la parte superior- a la izquierda muestra un promedio de 100 espectros registrados del sustrato vacío (cuarzo, verde) y tejido hepático tumoral (rojo) y el de la parte superior derecha muestra una parte ampliada del espectro para una mejor visualización de la línea de Na.

La Tabla 1 presenta para cada paciente el número de muestras LIBS y el número total de espectros registrados en el tumor y las áreas sanas. Las muestras del paciente 3 son solo tejido tumoral mamario cultivado en ganglios linfáticos (no tejido mamario sano).

La figura 2 muestra imágenes de dos láminas de referencia de ambos tipos de tejidos (hígado y mama). Las regiones tumorales están representadas por un color violeta oscuro (Fig. 2b y c, área marcada en rojo), mientras que las regiones sanas están indicadas por un color más claro (Fig. 2b y c, área marcada en azul). Las mediciones espectrales se limitaron a las áreas marcadas para garantizar la correcta identificación y etiquetado del tipo de tejido.

Los espectros resultantes se etiquetan con la clase correspondiente ("Tumor" o "Saludable") para su posterior análisis. Para evitar el sesgo (durante ML) basado en las condiciones experimentales, se registró un número comparable de espectros de cada tipo de tejido durante cada sesión experimental. En nuestro enfoque, el ML es una clasificación binaria y su objetivo es ordenar los espectros dados en las clases de "Tumor" y "Saludable". Cabe mencionar que durante la evaluación no se considera ninguna diferenciación de estadios tumorales. La clase "Saludable" tampoco tiene en cuenta el tipo de tejido o los tipos de células, sino solo la ausencia de células tumorales. El procesamiento de los espectros y el análisis mediante algoritmos ML se realizó a través de la aplicación informática para minería de datos, Orange versión 3.32.035.

Se recuperaron del archivo del Instituto de Patología de Nordhessen (Alemania) en cumplimiento de un voto del comité de ética para la investigación científica (proporcionado por Hessische Landesärztekammer, FF61/2014). De acuerdo con este voto aprobado, hemos estado utilizando muestras de tejido no vital de más de 10 años que contienen un exceso de material que ya no tiene relevancia diagnóstica. En tales casos, no se necesita el consentimiento informado de un paciente adicional.

Como primer paso, el entrenamiento y las pruebas del algoritmo ML se limitan a los espectros de las muestras de hígado. Incluyen grandes áreas de tumor y tejido sano, lo que brinda una alta certeza para identificar y etiquetar correctamente los espectros registrados. Esto proporciona una línea de base para el desempeño de nuestro método propuesto antes de extender el análisis a casos más complejos.

Una secuencia de pasos de preprocesamiento preparó los datos adquiridos para el análisis posterior. Al principio, los espectros inadecuados se clasificaron utilizando el widget "el factor de valor atípico local" dentro del software de Orange, que mide la desviación local de un espectro registrado dado con respecto a sus vecinos (usamos un factor de contaminación del 5 % para 25 vecinos). Además, los espectros que contienen una fuerte línea espectral de Si I a 288,34 nm indican que los pulsos láser también ablacionaron el sustrato de sílice fundida y todos los espectros que contienen a esta longitud de onda una señal más alta que el fondo más las fluctuaciones máximas de ruido aleatorio para este rango espectral fueron también eliminado. Para los datos restantes, se promediaron tres espectros adyacentes, reduciendo efectivamente el conjunto de datos en un tercio. Se aplicaron la sustracción de la línea de base y la normalización del vector de los espectros36 para corregir desviaciones menores del proceso de registro, como fluctuaciones en la energía de los pulsos de láser. No se usó el rango completo de los 1024 píxeles nativos del ICCD, pero se eliminaron 30 de ellos en cada extremo debido a algunas viñetas en las esquinas del sensor CCD. Finalmente, el conjunto de datos del hígado contenía un total de 2392 espectros promediados etiquetados como "Tumor" y 2544 como "Saludable" con 964 características (píxeles que corresponden a las longitudes de onda en los espectros registrados).

Los espectros de emisión inducida por láser registrados para ambas clases se presentan en la Fig. 3. Muestran líneas atómicas37 así como bandas moleculares38. Las líneas y bandas identificadas concuerdan con los espectros de emisión de tejido biológico presentados en otras publicaciones15,16,38,39. Cabe mencionar que en el caso de fs-LIBS, las líneas de emisión molecular son más fuertes que en el caso de los pulsos ns, como también señalaron otros autores27,28, y que la naturaleza de estas bandas es la fragmentación de moléculas orgánicas y no la reacción de carbono con nitrógeno en la atmósfera ambiente del laboratorio, como se analiza en la Ref.40. La doble línea de Ca II a 396,8 nm y 393,4 nm es la única contribución iónica en el espectro. Una diferencia visible en los espectros (ilustrado en la Fig. 3) entre las dos categorías es la relación de intensidad de la línea Na, pero la discriminación solo en esta línea no es tan precisa como usar algoritmos ML considerando la información espectral completa, que puede identificarla. con más detalle y proporcionar una mejor clasificación.

La siguiente evaluación de diferentes algoritmos de ML se realizó con el estándar de validación cruzada diez veces en el conjunto de datos del hígado. El rendimiento de los algoritmos se juzga por su capacidad para detectar cada clase por separado y el porcentaje general de decisiones correctas, es decir, la Precisión de clasificación (CA).

Se eligieron varios algoritmos con diferente complejidad y estructuras para analizar los datos: naïve Bayes, Árbol de decisión, Máquina de vectores de soporte, Vecinos más cercanos K, Bosque aleatorio y Redes neuronales. Su puntuación de CA está por encima de 0,85 e indica una muy buena capacidad de todos los modelos para discriminar las clases de tejido con precisión. Los tres algoritmos principales, a saber, redes neuronales artificiales (ANN), Random Forest (RF) y K-Nearest Neighbor (KNN), se adaptaron de manera óptima al conjunto de datos ajustando sus parámetros internos para obtener el mayor porcentaje de clasificación correcta. Para ANN usamos 512 neuronas en una capa oculta, 250 árboles en RF y 25 vecinos para KNN. Los resultados de los algoritmos entrenados se resumen en la Fig. 4, donde los diagramas de barras representan el porcentaje de la clasificación correcta. Los modelos ANN y RF pueden detectar ambas clases en el mismo nivel (con una puntuación CA ~ 0,95), mientras que el KNN es más sensible a los tumores (puntuación CA 0,88).

Porcentajes de clasificaciones correctas utilizando Redes Neuronales Artificiales, Random Forest y K-Nearest Neighbor for Tumor and Healthy liver tissue.

Los espectros presentados muestran distintas características, lo que plantea la cuestión de qué características (longitudes de onda) son relevantes para las decisiones del algoritmo. En esta sección se mostrará el análisis de la importancia de las líneas espectrales para la discriminación.

Un enfoque directo para esta tarea es invertir un algoritmo de tal manera que use la clase ("Tumor" o "Sano") como entrada y calcule un "espectro inverso", donde la intensidad de cada línea describe la importancia de la decisión del algoritmo. El RF y su estructura basada en árboles de decisión permiten el cálculo de dicho "espectro inverso" a través de la disminución media de impurezas para todos los árboles (efectivamente, qué tan bueno es el conjunto de datos asignado a cada clase para cada árbol y cada longitud de onda)41. La figura 5 muestra los resultados del cálculo. Es visible que el "espectro inverso" se asemeja a los registrados, aunque las intensidades de las líneas espectrales difieren significativamente. La línea de sodio tiene la mayor importancia para el proceso de decisión del algoritmo, lo cual se esperaba, ya que se observaron sus intensidades divergentes en los espectros registrados. El aumento de la emisión de la línea de Na en el tejido tumoral también ha sido discutido en otras publicaciones16,17 y se atribuyó al aumento intracelular de Na resultante de un cambio en la cinética Na+/H+ en un ambiente extracelular ácido. La banda C–N tiene la segunda puntuación más alta y las segundas intensidades más altas en los espectros reales y, junto con las bandas C–C, muestra la importancia de las señales moleculares para la toma de decisiones. Sin embargo, es fundamental mencionar que estas observaciones solo se aplican al modelo de RF y no son necesariamente aplicables a los otros modelos. No obstante, proporciona información sobre el proceso de toma de decisiones y muestra que los algoritmos utilizan líneas espectrales para identificar las clases.

El espectro inverso (puntuación de importancia para cada longitud de onda) del algoritmo Random Forest se superpuso con los espectros de emisión promedio registrados para el tumor hepático.

Destacamos que el uso de pulsos ultracortos en LIBS también permite el uso de bandas de emisión molecular en el análisis, a diferencia de ns-LIBS, donde la diferenciación se basa principalmente en líneas atómicas e iónicas. Reducir la dimensionalidad de los espectros42 usando como entrada en ML diferentes combinaciones de líneas atómicas o bandas moleculares genera un CA más bajo que usando toda la información espectral (resultados que no están dentro del alcance de este trabajo), por lo que nuestra prueba se centrará en mejores clasificaciones.

Después de observar la capacidad de los algoritmos de ML para identificar con precisión el tejido tumoral y demostrar que la toma de decisiones se basa en líneas espectrales con diversos grados de importancia, el siguiente paso es investigar la reproducibilidad de fs-LIBS y comprobar su aplicación como herramienta analítica. . Los procesos de ablación son complejos y sensibles a varios parámetros externos. Esta complejidad aumenta aún más para las investigaciones LIBS en tejido biológico, ya que su composición elemental es muy heterogénea. Para evitar este problema, en muchos estudios se utilizan puntos focales amplios para la irradiación, lo que reduce la resolución espacial y aumenta los daños colaterales13,43,44,45, o utilizan una gran cantidad de espectros para promediar14,15,18. Fs-LIBS tiene la ventaja de registrar espectros más reproducibles en comparación con ns-LIBS tradicional debido a su naturaleza determinista de ionización y la ausencia de interacción láser-plasma durante el pulso láser. El aspecto de la reproducibilidad y la consistencia del conjunto de datos se aborda de la siguiente manera: en la misma muestra de tejido hepático, realizamos mediciones en tres días diferentes en los que optimizamos la configuración para cada día individualmente. Por lo tanto, idealmente los espectros deberían ser los mismos, asumiendo que cada material extirpado dentro de un tipo de tejido contiene la misma composición elemental. En consecuencia, entrenar algoritmos de ML en los espectros registrados en un día y probarlos en los de otro día debería arrojar los mismos resultados. Por lo tanto, los tres modelos optimizados, KNN, RF y ANN, se probaron para todas las combinaciones posibles de los tres subconjuntos de espectros diarios. Todos estos algoritmos muestran una buena reproducibilidad día a día, con porcentajes de clasificación correcta superiores al 75% ya continuación comentaremos los resultados obtenidos mediante RF. La Figura 6 muestra las predicciones correctas para las clases Tumor y Healthy usando el algoritmo RF.

Reproducibilidad de las medidas en tejido hepático. Porcentaje de clasificaciones correctas cuando el algoritmo Random Forest se entrenó en un día y se probó con los datos medidos en un día diferente.

Las diferentes barras muestran una desviación visible del rendimiento del algoritmo. Por ejemplo, la capacidad de RF para detectar tejido tumoral varía en el caso de "Día de entrenamiento 1-Día de prueba 2" versus "Día de entrenamiento 1-Día de prueba 3" en aproximadamente un 20%. Sin embargo, se esperan desviaciones debido a muchos factores, como ajustes ligeramente diferentes de la configuración y la falta de homogeneidad del tejido biológico, afectarán el rendimiento de los modelos. Además, el modelo puede identificar con precisión cada clase con porcentajes superiores al 75% y puntuaciones de CA consistentes (no se muestran aquí) por encima de 0,88, lo que indica consistencia dentro del conjunto de datos.

El tejido mamario es uno de los más heterogéneos46. En las muestras patológicas que analizamos, las áreas con clara identificación de tumor y tejido sano eran más pequeñas que en el caso del tejido hepático (como se observa en la figura 2). Esto hizo que el procedimiento de medición fuera más difícil y aumentó la posibilidad de errores de etiquetado. Las muestras de mama se proporcionaron de tres pacientes diferentes y, por lo tanto, nos permitieron investigar el aspecto de la generalización en comparación con el conjunto de datos de hígado, que era solo de un paciente. Los espectros de tumor de mama y tejido sano son similares a los del hígado y se muestran en la Fig. 7.

Espectros de mama preprocesados ​​(sustracción de la línea de base y normalización del vector) de ambas clases (rojo = Tumor, azul = Saludable), incluida la distribución de señal respectiva de cada longitud de onda dentro del conjunto de datos (sombras de colores). La inserción en la parte superior derecha muestra una parte ampliada del espectro para una mejor visualización de la línea de Na.

La asignación de líneas y bandas espectrales, así como el procesamiento previo, la selección del modelo y el ajuste fino, se realizaron de manera análoga al conjunto de datos del hígado. Los tres modelos optimizados (KNN, RF y ANN) se desempeñan en un nivel muy alto con puntajes de CA consistentes por encima de 0,85 (KNN = 0,85, RF = 0,92 y ANN = 0,91) cuando se analiza el conjunto completo de espectros para los tres pacientes.

En el sentido de generalización, probamos la capacidad de los algoritmos para clasificar correctamente nuevos datos provenientes de pacientes desconocidos. Dentro de la escala de este proyecto, utilizamos el conjunto de datos de los dos pacientes con tumores primarios para el proceso de entrenamiento y probamos la capacidad de los algoritmos para identificar el tumor de metástasis en el tercer paciente. El grupo de entrenamiento consistió en espectros de ambas clases, mientras que el conjunto de prueba contenía solo espectros de tejido tumoral. Utilizamos espectros de 1985 Tumor y 2558 Healthy para la fase de entrenamiento, mientras que la prueba en el nuevo paciente se realizó en 1590 espectros de Tumor. La Figura 8 muestra los resultados de las clasificaciones correctas de los tres modelos.

Porcentajes de clasificaciones correctas de metástasis cuando los algoritmos fueron entrenados en tumores primarios de otros pacientes.

El porcentaje de 99,9 (KNN y RF) y 99,7 (ANN) muestra una tasa de predicción sorprendentemente excelente y sugiere el potencial de generalización. Sin embargo, dado que el grupo de entrenamiento constaba de dos pacientes y el grupo de prueba de un paciente con células de cáncer de mama en los ganglios linfáticos, se requiere un grupo más grande de pacientes para obtener conclusiones más definitivas.

Se ha demostrado que fs-LIBS se puede utilizar con muestras muy finas sobre un sustrato de vidrio de cuarzo y que la señal producida es lo suficientemente fuerte como para diferenciar el tejido hepático tumoral del sano con una alta resolución espacial. Identificamos correctamente el tipo de tejido usando una mezcla de LIBS cortados con micrótomo adyacentes y rebanadas de referencia. Los algoritmos Random Forest y Artificial Neural Networks fueron los que mejor se desempeñaron, clasificando correctamente tanto el tumor como el tejido hepático sano en más del 94 % de los casos. En este caso, el algoritmo K-Nearest Neighbor produjo una excelente identificación de tejido tumoral pero tuvo resultados modestos en el caso de tejido sano. Al usar el algoritmo de RF, se calculó la importancia de la característica, lo que llevó a la conclusión de que las bandas moleculares y la línea de sodio tienen prioridad en el proceso de decisión. La presencia de las líneas moleculares representa una de las ventajas de utilizar láseres ultracortos, que producen una buena firma espectral tras la ablación con pulsos de baja energía. Esto evita la disociación masiva del material biológico molecular como en el caso de los pulsos de láser ns, donde la discriminación del tipo de tejido se basa únicamente en las líneas atómicas o iónicas20,22,43. Se exploró la posibilidad de utilizar esta técnica en una paciente nueva y desconocida sobre muestras de mama con muy buena precisión de clasificación.

En el futuro, además de aumentar el número de pacientes y estudiar la influencia de la preparación de la muestra, queremos investigar la dependencia de la longitud del pulso para la diferenciación de tejidos. Con el fin de aumentar aún más la precisión de la identificación, junto con la mejora de la relación señal/ruido mediante el uso de pulsos de femtosegundos con retardo doble25, se utilizarán algoritmos numéricos más complejos47. Las posibles aplicaciones en el campo intraoperatorio deben considerar la disponibilidad de fuentes de láser, donde los láseres de fibra de alta tasa de repetición con duraciones de pulso más largas parecen ser prometedores48 y también pueden integrarse fácilmente en dispositivos endoscópicos.

Esperamos que este método se pueda utilizar in situ/in vivo como un método complementario al análisis patológico estándar.

Teniendo en cuenta la precisión espacial de la ablación con pulsos de láser de femtosegundos y el bajo volumen de muestra necesario, creemos que se podría obtener información intraquirúrgica sobre la naturaleza y la extensión del tumor después de entrenar los algoritmos de identificación en muestras de biopsia del mismo paciente. En un futuro lejano, cuando los láseres fs puedan usarse como herramientas quirúrgicas, este método podría ayudar a distinguir el tejido sano del enfermo directamente durante la incisión.

Los conjuntos de datos durante y/o analizados durante el estudio actual disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores desean agradecer a Sabrina Schuster, Andreea Cojocaru, Arne Ungeheur y al Dr. Vladimir Gross de la Universidad de Kassel por su ayuda en la mejora de la configuración experimental y los métodos de análisis. PD Dr. med. Kia Homayounfar de Klinikum Kassel, Dr. med. Hannah Fahrner y Dr. rer. nacional Matthias Fahrner de la Universidad de Freiburg agradecemos los debates útiles.

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. Los autores declaran que no se utilizó financiación externa.

Instituto de Física, Universidad de Kassel, Heinrich-Plett-Str. 40, 34132, Kassel, Alemania

Cristian Sarpe, Elena Ramela Ciobotea, Christoph Burghard Morscher, Bastian Zielinski, Hendrike Braun, Arne Senftleben & Thomas Baumert

Instituto de Patología del Norte de Hesse, Germaniastr. 7, 34119, Kassel, Alemania

Josef Ruschoff

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CS, ERC y CBM realizaron las mediciones y escribieron el manuscrito; ERC, CBM y BZ analizaron los datos. Todos los autores contribuyeron con discusiones críticas, leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Thomas Baumert.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sarpe, C., Ciobotea, ER, Morscher, CB et al. Identificación de tejido tumoral en muestras patológicas delgadas mediante espectroscopia de descomposición inducida por láser de femtosegundo y aprendizaje automático. Informe científico 13, 9250 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36155-8

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Recibido: 23 enero 2023

Aceptado: 30 de mayo de 2023

Publicado: 08 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36155-8

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